将冷冻组织切片放置在空间转录组芯片的捕获区域内，进行 HE 染色和成像后，对组织切片进行透化处理，细胞内的 mRNA 释放，从而被芯片上带有 oligo-dT 的探针捕获，并且每个探针都带有特异的位置信息（Spatial barcode），然后以 mRNA 为模版进行 cDNA 合成，构建文库后再通过测序，获得基因表达信息的同时，每一条测序 reads 因带有 Spatial barcode，从而能够获得基因表达的位置信息。

▲图 空间转录组技术的原理

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空间转录组技术包含两种芯片，分别为组织优化芯片（Tissue Optimization）和基因表达芯片（Library Preparation）。组织优化芯片用来摸索组织透化的时间，基因表达芯片用来进行正式样本的空间转录组实验。其中基因表达芯片上有 4 个捕获区域，每个区域大小为 6.5mm×6.5mm，每个捕获区域中有 5000 个带有特异地址序列的探针簇，称为 barcoded spots，每个 spot 直径为 55um，包含数百万个用于捕获的 oligo 探针序列，相邻两个 spot 的中心距离为 100um。探针序列的结构为：测序引物结合序列，16nt 的位置序列，12nt 的 UMI 序列以及 30nt 的 oligo-dT 序列。

▲图 空间转录组两种芯片

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▲图 空间转录组基因表达芯片工作原理

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▲图 空间转录组测序实验流程

方法一：组织冷冻（不常用）

1、异戊烷和液氮浴：如图所示，不锈钢烧杯内倒入异戊烷至 2 / 3 体积，然后将不锈钢烧杯放入液氮中（与异戊烷液位相同），孵育 15 分钟。

2、新鲜样本可用 PBS 冲洗，去除残留血液，然后使用实验室纸巾吸干组织表面多余的血液或液体，防止冰晶的形成（注：组织长和宽不可超过 6mm±0.2mm，否则后续实验无法贴片）。

3、用镊子或刮刀将组织整体浸没在异戊烷中，直至整体冰冻（注：冷冻时间可根据组织类型和大小而改变）。

4、冷冻后，取出组织转移到预冷的密封容器中，干冰转移至 -80°长期保存或立即进行下一步（注：为防止组织样品蒸发和脱水，冷冻的组织样品必须储存在密封容器中以长期保存）。

方法二：冷冻组织包埋（常用）

1、粉状干冰：用研钵和杵准备干冰粉。

2、冷冻 OCT：将 OCT 放在冰上≥30 分钟（注：OCT 请使用指定品牌）。

3、预冷镊子：将镊子放在干冰中≥30 分钟。

4、包埋盒上需标记组织样本的方向（注：在添加 OCT 和组织之前，需先在包埋盒上标记，因为一旦冻结，OCT 将迅速变成白色，这使得以后很难确定组织方向）。

5、用冷却的 OCT 铺平包埋盒底部，避免产生气泡。

6、从不锈钢烧杯中取出冰冻的组织，加入到 OCT 的包埋盒中心位置，继续倒入 OCT 覆盖样本。需避免气泡产生，尤其在组织附近。

7、立即将含有组织和 OCT 的包埋盒放在干冰粉上，直至整体冻结（约 20min 以上）。

8、将包埋盒放置到密封袋中，干冰运输。

注意事项

1、新鲜组织样本包埋

目前新鲜组织的包埋方法有两种，一种是液氮 + 异戊烷法；另一种的干冰法。对于临床手术切下来的组织样本一般使用干冰的包埋方法。对于穿刺样本等一些较小，较轻的样本，一般推荐用液氮 + 异戊烷的方法进行冷冻。OCT 包埋组织块可以在–80ºC 的密封容器中长期保存，或立即进行冷冻切片。

2、冷冻切片切、组织样本质控及贴片

由于空间转录组检测的是组织中的 RNA，因此要对切片中的 RNA 质量进行检测。我们一般取 10 片组织切片进行 RNA 抽提并质检，确定组织中 RNA 完整性（RIN>7）。所以要求我们的组织样本要保证可以切到至少 20 片 10um 厚度的切片，以便完成所有的实验。

3、组织优化

组织优化的目的是摸索样本的透化条件，保证组织切片中的 mRNA 能够充分释放。该步骤是获取真实实验结果的必要条件。否则，我们无法判断是基因表达高低到底是因为透化不充分导致的，还是实际就是这个样子。因此：每个样本建议都要做透化，尤其是临床样本。

4、成像

应使用 Visium Imaging Test Slide 验证成像设置。明场成像基准框和基准标记应清晰可见，并使用 Brightfeld 设置聚焦。Visium Imaging Test Slide 四个区域（A1，B2，C1，D2）具有荧光斑点，可通过 TRITC 和 Cy5 flter cubes 检测到，荧光设置应清晰可见 A1，B2，C1 和 D2 中的荧光点，且荧光点信号应从左到右减小。

5、正式实验

正式实验时要对反转录后的 cDNA 长度分布，浓度和量进行判断。cDNA 的长度分布在~200bp-9000bp 之间，在 1000bp 左右会有峰值（不同的组织类型会有些许差异）。

6、测序

在捕获区域，每个组织覆盖的 spot 建议至少测 50000 read pairs。整个捕获区域共有 5000 个 spots。可以根据组织贴到芯片上后，覆盖芯片的大小来判断测序的数据量。

计算公式（Coverage Area x total spots on the Capture Area)x 50,000 read pairs/spot  例如：组织覆盖了 60% 的区域，则数据量为（0.60 x 5,000 total spots) x 50,000 read pairs/spot=150 million read pairs。

图   切片覆盖芯片区域百分比

常见空间转录组的应用方向主要在肿瘤学，免疫学，发育生物学，神经科学及病理学等方向。

▲图   空间转录组的应用方向

▲表    已做过优化的样本类型

伯豪生物项目发文